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D-荧光素是荧光素酶的常用底物，普遍用于整个生物技术领域，特别是体内活体成像技术。D-荧光素也常用于体外研究，包括荧光素酶和ATP水平分析；报告基因分析；高通量测序和各种污染检测。

目前市场上有三种产品形式，D-荧光素（游离酸），D-荧光素（钠盐），和D-荧光素（钾盐）。这三种产品主要差别在于溶解特性。D-荧光素（游离酸）在水以及缓冲体系内的溶解性都很弱，除非溶于弱碱如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10mg/mL）和DMSO（50mg/mL）。但钠盐和钾盐形式的D-荧光素能够非常容易且快速的溶入水或者缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。配成溶液后的三种产品，在绝大多数应用上都没有实质性的差别。

在ATP和荧光素酶的作用下，D-荧光素（底物）被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染进入细胞后，导入研究动物如大小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

CAS号	2591-17-5
同义名	(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid；D-Luciferin Firefly,free acid；D-萤火虫荧光素游离酸
分子式	C11H8N2O3S2
分子量	280.32
纯度	＞99%(HPLC)
外观	类白色至浅黄色粉末
溶解性	溶于甲醇(10mg/mL)和DMSO(50mg/mL)，溶于弱碱，微溶于水。
结构式

• 萤火虫荧光素（firefly luciferin）和甲虫荧光素（beetle luciferin）皆相同化合物，仅不同公司在命名上的差异。
  
• 萤火虫荧光素在保存和操作的过程中需要避光。另，水溶性储存液经过滤除菌后，可置于-20℃或-80℃分装冻存，避免反复冻融。若条件允许，对储存液充氮气或氩气（防止氧化），稳定性和保存时间更长，长达1年。
  
• 萤火虫荧光素的注射方式，以及动物类型、体重等都会影响荧光信号发射，建议每次实验都要做荧光素酶动力学曲线，确定最佳信号平台期和最佳检测时间。
  
• 紫外线和潮气会产生脱氢荧光素，是一种荧光素酶的竞争性抑制剂。因此需小心保存和处理D-荧光素。最好-20℃避光干燥保存。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 体外生物发光检测：
  
  • 储存液制备：要溶解萤火虫荧光素游离酸到生理盐中，首先用NaOH或KOH调整缓冲液到预测的摩尔碱度，然后加入D-荧光素游离酸（如15mg/mL），边搅拌边促进溶解。如果仍有沉淀，调整pH到更高直至完全溶解。最后用酸调整pH到所需值。混匀后立即使用或分装于-80℃避光冻存，避免反复冻融。
    
    • 建议大量实验前先取少量原料（D-荧光素游离酸）溶于你的缓冲液，以测试其溶解性。
  • 荧光素酶反应缓冲液制备：
    1×配方：100mM Tris-HCl(pH7.8)，5mM MgCl₂，250μM CoA，150μM ATP。
    
    • 具体缓冲液组成可参考其他文献资料来调整。按照以上配方制备荧光素酶反应缓冲液（2×）。
  • 收集细胞裂解上清(荧光素酶表达)：根据需要检测的细胞类型，选择合适的裂解液进行细胞裂解，离心收集上清后续检测待用。
    
  • 萤火虫荧光信号检测：
    
    • 萤火虫荧光信号的检测方法大体上取决于冷光测定仪（luminometer）类型（是手动型荧光计、单管注射型或者酶标板读数型荧光计）。根据特定发光测定仪，来考虑注射用量和程序设置。
      
    • 需设置不含荧光素酶的孔（用作阴性对照），以测定背景荧光。
    例：注射式冷光测定仪（injectible luminometer，单样或微孔板，200μL终体积）
    
    • 吸取100μL荧光素酶反应缓冲液（2×）到一干净的冷光测定仪比色皿或96孔板的各孔（最好使用全白平底的96孔板）；
      
    • 吸取50～98μL裂解上清到皿或孔内；
      
    • 如果有需要，用水来补足使得总体积到198μL；
      
    • 设置程序注射2μL荧光素储存液（使工作浓度150μg/mL），程序：2～5秒延迟（delay），之后10s测定。
• 活体成像分析：
  
  • 工作液准备：准备少量的PBS（w/o Mg²⁺）,pH=12以及PBS（w/o Mg²⁺）,pH=2缓冲液。先取10mg D-荧光素游离酸到165mL PBS（w/o Mg²⁺）,pH=12，充分溶解后，再加入165mL PBS（w/o Mg²⁺）,pH=2中和溶液，混匀得到30mg/mL的工作液。0.2μm滤膜过滤除菌。混匀后立即使用或分装于-80℃避光冻存，避免反复冻融。一旦使用，放到4℃解冻，保持冰冷且避光。
    
  • 注射方式：适用于静脉注射，腹腔注射，肌肉注射和鼻内注射等，根据具体方式调整注射体积，最常用的注射浓度为150mg/kg体重。
    
  • 检测方式：注射入体内10～20min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析。
    
    • 建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。